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楊鵬遠(yuǎn)（左二）正在點(diǎn)樣。受訪者供圖

■本報記者 張思瑋

54年前，美國賓夕法尼亞大學(xué)的醫(yī)學(xué)和人類學(xué)教授Banuch Blumberg發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒（HBV）（簡稱乙肝病毒）?；蛟S他并沒有想到，自己能因此獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，也更沒想到，此后半個世紀(jì)，人類與乙肝病毒的交手一直“難解難分”。

“如今，雖然有了干擾素、核苷類藥物等多個抗擊乙肝病毒的治療武器，但因HBV可以在人體肝臟細(xì)胞核內(nèi)形成共價閉合環(huán)狀DNA分子（cccDNA）和整合入人體基因組，使其病毒DNA形式能穩(wěn)定存在。而這也正是HBV能在體內(nèi)維持長期慢性感染且難以清除的關(guān)鍵?！敝锌圃荷镂锢硭芯繂T楊鵬遠(yuǎn)在接受《中國科學(xué)報》采訪時表示，研究乙肝病毒與宿主基因組相互作用特征具有重要意義。

基于此，楊鵬遠(yuǎn)課題組與北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院季雄課題組聯(lián)手合作，采用3C-HTGTS技術(shù)系統(tǒng)地闡述了乙肝病毒cccDNA和整合形式的HBV—DNA與宿主基因組相互作用的特征，為HBV感染及相關(guān)疾病治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。相關(guān)研究成果近日發(fā)表于《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》。

報告病例數(shù)第一的乙類傳染病

乙肝病毒感染是全球性重大公共衛(wèi)生健康問題之一。目前，全球乙肝病毒慢性感染者約2.6億人，每年接近100萬人死于慢性乙肝導(dǎo)致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌。

衛(wèi)健委發(fā)布的《2019年全國法定傳染病疫情概況》指出，病毒性肝炎依然是我國傳染病報告病例數(shù)第一的乙類傳染病。根據(jù)2020年世界肝炎日的報道數(shù)據(jù)顯示，我國仍有約7000萬乙肝患者，需要進(jìn)行治療的患者人數(shù)大約2000萬到3000萬。

“隨著乙肝疫苗的普及和免費(fèi)接種，我國對乙肝的防控效果顯著，人群感染率在穩(wěn)步下降，尤其是兒童感染率控制得很好?！北本﹨f(xié)和醫(yī)院肝臟外科主任醫(yī)師杜順達(dá)告訴《中國科學(xué)報》。但乙肝感染問題仍不容忽視。

據(jù)了解，乙肝感染率比較高主要因?yàn)槲覈囊腋卧\斷率（18%）和治愈率（11%）比較低。乙肝感染初期癥狀隱匿，這就意味著很多人在不知情的情況下成為感染者和傳染源，而一旦感染很難治愈。另一個原因是母嬰傳播。

此外，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年肝癌高居我國癌癥發(fā)病率第5位、死亡率第2位。并且，此前有研究指出，我國約80%的肝癌與HBV感染相關(guān)。

“如果控制好乙肝病毒感染，或許就能直接減少肝癌的發(fā)病率。”杜順達(dá)說。

病毒與宿主細(xì)胞如何互動

相比丙型肝炎病毒（HCV），HBV更加難纏。

究其原因，楊鵬遠(yuǎn)解釋稱，HBV屬嗜肝DNA病毒科，cccDNA利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制，能夠合成HBV所需的所有RNA和蛋白。而現(xiàn)有的乙肝治療藥物（拉米夫定等核苷類似物）雖然能通過抑制p蛋白（HBV聚合酶）功能抑制HBV復(fù)制，但其無法清除感染者細(xì)胞內(nèi)cccDNA及整合形式的病毒DNA。因此當(dāng)乙肝感染者停藥后，病毒DNA可以利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制，重新合成HBV所需的RNA和蛋白，從而完成病毒復(fù)制。

而HCV是一種正鏈RNA病毒，其復(fù)制過程中不存在cccDNA類似中間體。丙肝感染者服用丙肝治療藥物后能有效降低HCV RNA水平，從而消除HCV，實(shí)現(xiàn)丙肝治愈。

因此，清除長期穩(wěn)定存在于人體細(xì)胞核內(nèi)的病毒DNA是乙肝治療的關(guān)鍵。那么，這就引出一個科學(xué)問題：HBV cccDNA和整合形式的病毒DNA如何穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，以及怎樣才能有效清除這些病毒DNA。

“這其中首先要弄清楚病毒DNA與宿主細(xì)胞的相互作用模式和特點(diǎn)?！睏铢i遠(yuǎn)說。

為此，兩個研究團(tuán)隊(duì)采用3C-HTGTS技術(shù)在HBV感染HepG2-NTCP細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA與宿主基因組的相互作用傾向于富含H3K4me3、H3K9ac、H3K4me1和H3K27ac等組蛋白修飾的活躍增強(qiáng)子和啟動子。

3C-HTGTS也是季雄課題組采用的一種新穎的one-to-all染色質(zhì)互作檢驗(yàn)方法?！霸摲椒▋H需一步限制性酶切和連接交聯(lián)后的染色質(zhì)，理論上可以選用任意識別4bp 序列的內(nèi)切酶，從而使染色質(zhì)片段化程度和染色質(zhì)互作檢測的分辨率更高。”季雄說。

值得一提的是，研究人員利用這種方法還檢測到一種全新的互作形式：在穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepAD38細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，整合形式的HBV-DNA能夠和宿主基因組DNA形成染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)，并且傾向于和宿主基因的啟動區(qū)域互作。

繼續(xù)深耕病毒作用機(jī)制

“雖然國內(nèi)外很多同行都檢測到了HBV可在人的基因組內(nèi)整合，但我們首次發(fā)現(xiàn)這種整合能在整合區(qū)域進(jìn)一步與周圍人染色質(zhì)發(fā)生相互作用?！睏铢i遠(yuǎn)表示。

研究發(fā)現(xiàn)，HBV cccDNA與宿主基因組中富含H3K4me1區(qū)域相互作用，進(jìn)而通過染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP-qPCR）發(fā)現(xiàn)，HBV cccDNA上確實(shí)存在豐富的組蛋白H3K4me1修飾。當(dāng)敲低細(xì)胞內(nèi)的介導(dǎo)組蛋白H3K4me1發(fā)生的賴氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶2C/D（KMT2C/D）時，HBV RNA轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，上清中分泌的HBV表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）含量顯著降低，結(jié)果提示HBV cccDNA可通過宿主甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

采訪中，記者了解到在研究過程中，他們遇到的最大困難就是可用和好用的HBV感染模型太少，尤其是小動物體內(nèi)模型更少。

幸運(yùn)的是，早在2012年，北京生命科學(xué)研究所研究員李文輝團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)NTCP是HBV感染受體，并開發(fā)了HepG2-NTCP細(xì)胞模型，該模型為細(xì)胞水平HBV感染帶來了很大便利。

“此次研究中，我們就采用的是HepG2-NTCP細(xì)胞模型。”楊鵬遠(yuǎn)說，未來，他們將繼續(xù)研究HBV整合人基因組的機(jī)制及其與人染色質(zhì)互作的有效靶標(biāo)，為提出對HBV誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的調(diào)控機(jī)制和相應(yīng)靶向新策略創(chuàng)造條件。

相關(guān)論文信息：

https://doi.org/10.1038/s41421-020-00218-1